Genética Reversa, una herramienta para la generación de vacunas contra Influenza Aviar

La genética reversa es un proceso mediante el cual se pueden generar o modificar organismos a través de la manipulación de sus genes. Las técnicas de genética reversa se utilizan en virología, y se definen como la generación de virus completos a partir de ADN complementario (ADNc). Estas técnicas brindan la posibilidad de generar y modificar virus que pueden utilizarse como modelo para estudiar características virales, análisis genéticos, vectores virales y vacunas.

Los virus de influenza, pertenecen a la familia Orthomyxoviridae, tienen un genoma de ácido ribonucleico (RNA) de cadena sencilla, en sentido negativo, de 8 segmentos. Los segmentos codifican para las proteínas PB1, PB2, PA, HA, NA, NP, M1, M2, NS1 y NEP los cuales se encuentran en el interior del virión formando Ribonucleoproteínas independientes, lo cual permite una distribución del genoma en plásmidos independientes correspondientes a cada segmento.

Los plásmidos son anillos de ADN que provienen de bacterias que han desarrollado resistencia a antibióticos, esa resistencia se debe a la producción de enzimas que inactivan a los antibióticos, la capacidad de sintetizar estas enzimas se encuentra codificada en anillos de ADN que permanecen libres en el citoplasma  y que son independientes del ADN principal de la bacteria, aunque en algunos casos pueden integrarse al cromosoma principal, y a estos pequeños anillos de ADN se les llama plásmidos. El segmento génico y el vector plásmidico se unen covalentemente, y mediante un proceso conocido como transformación, bacterias previamente tratadas con sales que forman poros en la membrana bacteriana, se someten a un choque térmico o a un proceso de electroporación, mediante el cual los plásmidos pueden ser introducidos. Las bacterias una vez que incorporan el plásmido, desarrollan un mecanismo de resistencia a algún antibiótico específico, de esta manera el plásmido se vuelve indispensable para la replicación de la bacteria en un medio selectivo con antibiótico. En la figura 1 se describen los elementos que puede contener un plásmido.

Las técnicas de genética reversa para el rescate de virus influenza surgen en 1990. El laboratorio del Dr. Palese desarrolló un sistema que utilizaba plásmidos y un virus ayudante, esto permitió el intercambio de genes del virus influenza por segmentos sintéticos de ADNc. En 1999 se desarrolló un sistema de 12 plásmidos que permitía el rescate viral sin la utilización de virus ayudante. La técnica consistía básicamente en transfectar células con 8 plásmidos que codifican el genoma viral, y utilizar 4 plásmidos ayudantes que codifican para las proteínas NP, PB1, PB2 y PA. Los plásmidos ayudantes utilizan un promotor de la polimerasa II que permite la expresión proteica, y de esta manera los plásmidos pueden encapsular, transcribir y replicar el genoma viral codificado por los otros 8 plásmidos.

Figura 1. Esquema general de un plásmido. 1) Sitio de origen, 2) Gen de resistencia a antibióticos, 3) Sitio múltiple de clonación, 4) Gen insertado, 5) Promotor para iniciar la transcripción, 6) Sitio de unión de los oligos, 7) Marcador de selección (puede o no estar presente), codifica resistencia a otros antibióticos. Imagen tomada y modificada de Addgene.

En el año 2000 el equipo del Dr. Webster logro desarrollar un sistema de 8 plásmidos para el rescate de virus influenza. Los plásmidos contenían el ADNc de cada fragmento del genoma viral insertado entre el promotor de Polimerasa I (Pol I) y el terminador de Pol I, flanqueando por el promotor de Polimerasa II (Pol II) de citomegalovirus humano (CMV), y la señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovino (BGH). La orientación opuesta de los promotores permitía la síntesis de RNAv y de RNAm. Al disminuir el número de plásmidos necesarios para la transfección se incrementaban las probabilidades de un rescate exitoso. Los vectores biscistronicos, que permiten la expresión de RNAv y RNAm de influenza, se han modificado para volverlos más eficientes, como el vector phw2000 (Figura 2).

Las técnicas de genética reversa para el rescate de cepas virales que permitan el desarrollo de vacunas no ha sido aplicado exclusivamente a influenza; virus como poliovirus, rinovirus y el virus de la coriomeningitis linfocítica, también se han rescatado con esta técnica. La generación de virus recombinantes nos permite evaluar características virales, como mutaciones que otorgan resistencia antiviral, y su efecto en la replicación del virus; Sin embargo, la aplicación para la cual se utilizan principalmente los virus recombinantes de influenza es la generación de vacunas para virus de alta patogenicidad. Se pueden generar virus modificados sin el sitio de corte de alta patogenicidad que disminuyen la patogenicidad de algunas cepas y permiten utilizarse de forma más segura que las cepas silvestres.

Figura 2. Generación de proteínas virales a partir de un plásmido bidireccional. Proceso de transfección de ocho plásmidos bidireccionales a partir de los promotores de Pol I se sintetizan los RNA transicionales vRNA, y a partir de los promotores de Pol II se sintetizan los mRNA para síntesis de proteínas. Imagen tomada y modificada de Hoffmann et al 2000.

El proceso de generación de virus de Influenza a través de plásmidos bidireccionales inicia con la transfección de células que contengan polimerasas capaces de reconocer los promotores presentes en el plásmido para iniciar la transcripción de los segmentos de interés para la posterior síntesis de proteínas, algunas de las cuales participaran en la generación de las ribonucleoproteinas virales, de esta forma se pueden generar virus estructuralmente completos, con un genoma con la capacidad de replicarse, pero con las características que hayan sido modificadas en los plásmidos de interés, de esta manera por modificaciones en el diseño de los plásmidos de HA se puede cambiar la patogenicidad de los virus de influenza aviar, permitiendo la generación de virus de baja patogenicidad, capaces de generar inmunidad protectiva contra cepas de alta patogenicidad a partir de las cuales se diseñaron.

Referencias

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Addgene. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/plasmid-background/