Herramientas diagnósticas para influenza aviar

La influenza aviar es definida como una enfermedad viral que afecta tanto a las aves domésticas como silvestres, se caracteriza por ser altamente contagiosa y su distribución es global. Es ocasionada por un virus de la familia Orthomyxoviridae, el virus de Influenza se clasifica en 4 tipos: A, B,C y D. La influenza tipo A es la única que se ha reportado con la capacidad de infectar a las aves y tiene un potencial zoonótico importante. Con base en el cuadro clínico que se presenta, la influenza aviar se clasifica como de baja patogenicidad (IABP) la cual puede cursar como un cuadro subclínico y localizado en el aparato respiratorio o digestivo, y de alta patogenicidad (IAAP) que ocasiona cuadros clínicos severos debido a la afectación sistémica y la presencia de una alta mortalidad.

Los virus de influenza tipo A se dividen en subtipos según las combinaciones de diferentes tipos de dos proteínas de superficie conocidas, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (N). Hay 18 subtipos diferentes de hemaglutinina y 11 de neuraminidasa. En aves se han identificado 16 tipos de HA y 9 de N. Los subtipos de IA de alta patogenicidad que afectan gravemente a la avicultura comercial son H5 y H7.

La presencia de la influenza aviar tiene una repercusión económica que puede ser devastadora para la industria avícola a nivel local y global, afectando las fuentes de empleo, la restricción del comercio nacional e internacional de productos avícolas, así como un impacto en el consumo de una fuente de proteína para las personas.

Las aves silvestres son consideradas el reservorio natural para los virus de influenza y juegan un papel importante en su preservación, evolución y persistencia, así como su propagación hacía las aves domésticas asociada con las rutas migratorias que siguen. La enfermedad es de reporte obligatorio por la implicaciones sanitarias y económicas, también se le considera un riesgo de salud pública debido a las características zoonóticas de estos virus.

MEDIDAS DE PREVENCIÓN Y CONTROL

Se debe tomar en cuenta la presencia de reservorios naturales de esta enfermedad y criar a las aves de producción en sistemas de confinamiento que limiten el contacto y la exposición.

Seguimiento de medidas de bioseguridad que incluyen entre otros el control de acceso a las granjas, procesos adecuados de limpieza y desinfección de instalaciones, disposición de desechos y vacunación en zona enzoóticas y autorizadas.

Otras medidas de control incluyen la detección temprana de la enfermedad a través de análisis de laboratorio, el sacrificio de parvadas positivas, establecimiento de cercos sanitarios perimetrales, monitoreo y vigilancia epizootiológica y regulación del comercio.

CONSIDERACIONES ACERCA DE LA VACUNACIÓN

• La vacunación en zonas enzoóticas debe realizarse con base en el conocimiento del subtipo de virus, su comportamiento epizootiológico y los tipos

de aves de producción que hay en la zona.

• La vacunación en zonas libres deberá estar basada en un análisis de riesgos, en apego a la información de los programas de vigilancia epizootiológica

existentes y con las autorizaciones pertinentes.

• Las vacunas seleccionadas deben ser fabricadas con apego al Manual de pruebas de diagnóstico y vacunas para los animales terrestres (Manual) de la OIE y aportar pruebas de su eficacia en la reducción de la excreción viral previniendo así la circulación del virus en la especie objetivo.

• Debido al alto riesgo de mutación y recombinación viral, no es seguro el uso de vacunas con virus activos atenuados. Para la elaboración de vacunas se utilizan virus inactivados.

• Las vacunas a virus inactivado generan una buena protección contra el desafío, pero requieren ser homologas a las cepas circulantes.

• Se debe considerar que no existe protección cruzada entre subtipos de IA

• Los anticuerpos generados por la vacunación no pueden ser diferenciados de los producidos por una infección de campo con las pruebas serológicas disponibles.

DIAGNÓSTICO

No deberá basarse únicamente en los signos clínicos, ya que estos son comunes a varias enfermedades y no son raros los casos donde se encuentran infecciones simultaneas por otros virus. Se requiere la realización de pruebas diagnósticas que confirmen la presencia del virus de manera directa o indirecta.

Se deben entender adecuadamente los fundamentos de cada una de las pruebas para apoyar su correcta interpretación.

Los métodos diagnósticos para la influenza aviar se clasifican en dos grupos, las pruebas directas e indirectas, las primeras detectan la presencia del virus o su material genético en una muestra sospechosa y las segundas detectan la presencia de anticuerpos producidos por el sistema inmune de las aves afectadas.

El diagnóstico virológico basado en la detección del agente viral puede ser a través de técnicas moleculares como el RT-PCR (Reacción en Cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa) o el aislamiento viral a partir de muestras de órganos o fluidos. Las pruebas diagnósticas que detectan la presencia de anticuerpos en suero, utilizadas para el diagnóstico de IA son Inhibición de la hemaglutinación (HI) o la prueba de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA).

DETECCIÓN VIRAL

Tiene como objetivo determinar la presencia del virus en granjas y zonas específicas, a su vez permite el monitoreo epizootiológico de la enfermedad. Los métodos de secuenciación de ADN son herramientas básicas para estudios moleculares y genómicos.

AISLAMIENTO VIRAL

El aislamiento en cultivos celulares o huevos embrionados y la subsecuente identificación mediante técnicas inmunológicas o moleculares son los métodos más sensibles para el diagnóstico de infecciones virales. Una de las mayores ventajas es que se dispone del virus activo a nivel del laboratorio para realizar investigaciones sobre la composición antigénica y caracterización genética, el grado de patogenicidad, preparación de vacunas, entre otros. Los huevos embrionados de gallina fueron uno de los primeros métodos utilizados en el aislamiento viral y continúan siendo uno de los métodos más sensibles para el aislamiento de virus influenza aviar.

RT-PCR

Conocida como Reacción en Cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa, es una técnica molecular que está basada en la generación de una gran cantidad de copias de ADN complementario a partir de una hebra de ARN viral por acción de una enzima (transcriptasa inversa) y el resultado de este proceso se amplifica con una prueba de PCR tradicional. La amplificación exponencial mediante RT-PCR es una técnica altamente sensible y específica por detectar números bajos de copias de ARN viral en las muestras sospechosas.

SECUENCIACIÓN DEL GENOMA Y CARACTERIZACIÓN GENÉTICA

El genoma de un virus se compone de todos los genes que conforman su material genético. En el caso de los virus de influenza, estos sufren cambios constantes o mutaciones que pueden reconocerse a través del análisis de la secuenciación de los nucleótidos en un gen específico cuando se comparan con los de otros virus de Influenza. Las variaciones genéticas son importantes porque pueden incidir en la estructura de las proteínas de superficie del virus, la sustitución de un aminoácido por otro puede afectar algunas de sus características, como la morbilidad o la capacidad de ser reconocidos y neutralizados por los anticuerpos generados por las vacunas comercialmente disponibles.. La secuenciación es un proceso que determina el orden o la secuencia de los nucleótidos en cada uno de los genes presentes en el genoma del virus, entre los más estudiados se encuentran los segmentos que codifican para las dos principales proteínas de superficie: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Las cuales determinan importantes propiedades del virus como su capacidad de infección y su patogenicidad.

CARACTERIZACIÓN GENÉTICA/ÁRBOLES FILOGENÉTICOS

El proceso de comparar la secuencia genética de los virus se denomina caracterización, la cual se utiliza para:

• Determinar qué tan relacionados genéticamente están los virus de la influenza o el grado de similitud que hay entre ellos.

• Monitorear cómo evolucionan los virus de la influenza.

• Identificar los cambios genéticos que afectan las propiedades del virus.

• Evaluar el grado de eficacia de las vacunas contra la IA para generar protección.

Las diferencias relativas que se observan en un grupo de virus de influenza se organizan y se muestran de forma gráfica lo que se conoce como árbol filogenético. Por lo general, los árboles filogenéticos de los virus de influenza muestran la similitud que hay entre los genesanalizados). Cada secuencia de un virus de influenza específico tiene asignada una rama del árbol. El grado de diferencia genética (cantidad de diferencias en los nucleótidos o aminoácidos) entre los virus se representa con el largo de las líneas horizontales (ramas) en el árbol filogenético. Mientras más alejados están los virus en el eje horizontal del árbol filogenético, más diferentes genéticamente son unos de otros.

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIRUS DE INFLUENZA AVIAR

A través de la detección y cuantificación de anticuerpos específicos contra el virus de IA se puede determinar si ha habido exposición de las aves hacia el antígeno en condiciones de campo o bien sea por una vacunación, estimando el nivel de seroconversión en los animales inmunizados. Las pruebas serológicas se utilizan cuando las muestras para aislamiento viral o detección de antígenos resultan negativas, inadecuadas o no están disponibles, además de que pueden detectar la seroconversión de anticuerpos específicos, en muestras de suero en fase de enfermedad aguda y convaleciente.

Para una adecuada interpretación de estas pruebas, en el caso de las aves que son vacunadas, se deben considerar que existen títulos de anticuerpos maternos en las aves jóvenes, que brindan protección en las primeras semanas de vida, y establecer adecuadamente los títulos que se consideran positivos y aquellos que alcanzan un nivel que puede brindar protección como consecuencia de las prácticas de vacunación en las aves de distintas edades y fines zootécnicos.

Es importante considerar que la producción de anticuerpos hacia un antígeno y su detección en el suero de las aves toma de 5 a 7 días después de la exposición, en el caso particular de IA la vacunación con emulsiones a virus inactivado genera anticuerpos detectables a partir de los 11-14 días posteriores a la aplicación, puede existir variación en este tiempo si la vía de aplicación fue subcutánea o intramuscular.

INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (HI)

La glicoproteína de superficie Hemaglutinina (HA) de los virus de Influenza tiene la propiedad biológica de aglutinar glóbulos rojos de algunas especies animales, los anticuerpos específicos contra la HA presentes en el suero de las aves, pueden unirse a la HA e impedir su unión a los receptores presentes en la superficie del eritrocito lo que constituye el principio de la técnica de HI, la cual es altamente específica y sensible, pero se requiere disponer de antisueros específicos para los subtipos de IA que se estén evaluando.

Se utilizan diluciones del suero para cuantificar el nivel de anticuerpos presentes. El título corresponde a la dilución más alta del suero que causa la inhibición completa de la aglutinación por parte del antígeno.

ELISA. INMUNOENZAYO LIGADO A ENZIMAS

El fundamento de la prueba se basa en la unión antígeno-anticuerpo. Existen pruebas comerciales de ELISA que permiten la detección de anticuerpos contra la proteína de la nucleocápside, son de formato indirecto y de competición/bloqueo. El antígeno que usualmente es una proteína de la nucleocápside se encuentra adherido al fondo de los pozos, los cuales al ponerse en contacto con una muestra de suero sospechosa, permite la unión de los anticuerpos (en caso de estar presentes) a los antígenos de la placa, posteriormente se añaden los anticuerpos monoclonales marcados, los cuales compiten con el anticuerpo de la muestra por los antígenos disponibles, así al realizarse la reacción enzimática el color generado en la reacción es inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-Influenza A en la muestra a analizar. Los resultados se expresan con la proporción en densidad óptica de la muestra con respecto al control negativo. A partir del punto de corte determinado las muestras son positivas o negativas.

El uso de los kits ELISA es útil para el monitoreo de parvadas, pero los diagnósticos positivos deben seguir de la realización de pruebas de HI para la tipificación del subtipo. Actualmente existen disponibilidad de pruebas que pueden determinar anticuerpos de específicos de acuerdo con el subtipo de IA por ejemplo contra H5, H7 y N1.

TOMA Y ENVÍO DE MUESTRAS

El resultado de las pruebas de laboratorio depende de la calidad de la toma y envío de muestras. Es importante incluir información mínima de las parvadas de origen y una historia clínica.

Las muestras de suero se obtienen a partir de la toma de muestras sangre, obtenidas por la punción de vasos sanguíneos (vena yugular, braquial) con jeringas y agujas de un calibre adecuado (21-22G x 1”, jeringa capacidad 3 ml) para evitar la hemólisis de la muestra y que esto pueda ocasionar una interferencia analítica de los sueros. La colecta se realiza en tubos sin aditivo (anticoagulante) de un mínimo de 20 aves. El volumen va de 1-2 mL dependiendo de la edad y el tamaño de las aves. Se deben dejar inclinados para que una vez formado y contraído el coagulo, se libere el suero y este pueda ser separado en microtubos o viales. Nunca envíe al laboratorio la muestra sanguínea completa, se debe separar y enviar solo el suero. Las muestras son viables para su procesamiento hasta 5 días después si se mantienen refrigeradas. Si el tiempo hasta el proceso será mayor, los sueros deben mantenerse congelados a – 20°C. En condiciones de congelamiento pueden permanecer viables durante meses, siempre y cuando no se sometan a más de 3 – 5 ciclos de congelación/descongelación.

Para su envío al laboratorio se debe asegurar que los tubos o viales se encuentre perfectamente cerrados para evitar que se derramen, de preferencia conservar una posición vertical durante su traslado y estar debidamente identificados. La temperatura debe ser de 2-8°C.

CONCLUSIONES

• Los programas de control de la influenza aviar deben estar apoyados por herramientas diagnósticas precisas, rápidas e integrales que permitan un adecuado monitoreo epizootiológico por regiones.

• Conocer el fundamento de las pruebas diagnósticas disponibles y tener en cuenta que algunas evalúan la respuesta serológica del ave hacia el antígeno de IA sea vacunal o no y otras determinan la presencia de este en las parvadas para poder lograr una interpretación adecuada de los resultados.

• Los resultados de las pruebas de laboratorio dependen directamente de la calidad de la toma y envío de muestras y también de tomarlas en momentos adecuados donde podamos apreciar una respuesta serológica o bien la excreción viral alcance una concentración de partículas que permitan o faciliten su aislamiento.

• Las pruebas serológicas son muy útiles por su especificidad y sensibilidad, para evaluar adecuadamente la respuesta serológica a una vacunación es necesario que exista homología entre las cepas utilizadas para la producción de vacunas y los antígenos para realizar las pruebas. En el caso de evaluaciones serológicas con fines diagnósticos la respuesta dependerá de la homología con la cepa de campo que circule en la región.

• Las pruebas para detectar la presencia del antígeno son determinantes para establecer medidas de control adecuadas. Aun cuando se determina la presencia de material genético de los virus de IA en las muestras no su actividad biológica, un resultado positivo indica circulación de un virus de campo, ya que la vacunación en nuestro país se realiza únicamente con virus inactivados.

• El monitoreo epizootiológico de las parvadas apoyado en las pruebas diagnósticas es indispensable debido a la alta variabilidad genética y mutaciones características de los virus de IA.

BIBLIOGRAFÍA

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