Secuenciación

La biología molecular en los últimos años ha sido degran importancia en la salud y en las aplicaciones biotecnológicas. Algunos de los conocimientos más populares derivados de la biología molecular son la codificación química de información en el ADN, la secuenciación del genoma humano, la posibilidad de las terapias génicas, el diagnóstico molecular de enfermedades y la clonación de genes.

La secuenciación de ADN permite determinar el orden de los nucleótidos (A, G, C, T) en una molécula. La mayoría de las técnicas de secuenciación a baja escala que se usan actualmente se basan en el método de síntesis enzimática conocido como método Sanger o de terminación de la cadena.

De todos los métodos históricos de secuenciación de ácidos nucleicos diseñados por Sanger, el método por terminadores dideoxi es el más exitoso (Sanger, 1988). Con esta técnica Fred Sanger y colaboradores (1977b) secuenciaron el primer genoma viral de ADN llamado PhiX174. Con este método se han generado una gran cantidad de secuencias, por lo que a principios de los ochenta fue necesario crear bases de datos universales para resguardar la información y hacerla accesible a los usuarios. En 1982, se crea el Gen Bank a través del National Center for Biotechnology Information (NCBI), dónde se contaba con más de 2000 secuencias y para principios del 2011 esta base de datos resguarda más de 100,000,000 secuencias.

Las técnicas actuales utilizan dideoxinucleotidos marcados con fluorocromos, para la identificación de los fragmentos. Este método es útil para la secuenciación de genes o fragmentos individuales de ADN y en proyectos de secuenciación a baja escala que involucran un número reducido de fragmentos.

MÉTODO DE SANGER O DE LOS DIDEOXINUCLEÓTIDOS

De forma resumida, el proceso sería el siguiente. En primer lugar, se llevan a cabo cuatro reacciones distintas en tubos diferentes. Cada uno de los tubos va a contener una mezcla que contiene la misma cadena molde (ADN de simple cadena o ADNc procedente de una retrotranscripción de ARN), la ADN polimerasa, un cebador marcado radiactivamente, los cuatro nucleótidos normales (dNTP) y uno de los cuatro dideoxinucleótidos (ddNTP). Así, el cebador, por complementariedad, se une a la hebra molde favoreciendo su reconocimiento por la ADN polimerasa y el inicio de la síntesis de la nueva hebra. La ADN polimerasa va añadiendo dNTPs hasta que de forma aleatoria, incorpora el ddNTP, por ejemplo, el ddATP (cada uno de los tubos contiene un ddNTP distinto) y se interrumpe la síntesis. De esta forma, en el tubo van a aparecer fragmentos secuenciados de diferentes tamaños e interrumpidos por el ddNTP del mismo tipo (en este caso ddATP). A continuación, el contenido de cada uno de los tubos se corre en carriles diferentes de un gel de acrilamida. Finalmente, tras separar en función del tamaño, y gracias al cebador marcado con fluorescencia, se van a poder contemplar diferentes bandas que van a poder ser traducidas en diferentes nucleótidos.

La secuenciación Sanger es utilizada fundamentalmente en estudios de procesos biológicos y aplicaciones en campo tal es el caso de investigación forense o de diagnóstico; así como la identificación taxonómica de aislados microbiológicos y virus principalmente en la industria veterinaria.

AVANCES DE LA SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

La secuenciación de ADN se encuentra de nueva cuenta en la frontera de la investigación. Esto se debe a que los nuevos métodos están desplazando la metodología de Sanger y están cambiando hacia una secuenciación por síntesis catalizada por la ADN polimerasa. Por lo que, si al ADN a secuenciar se le incluyen, mediante pasos sencillos de ligación y PCR, nucleótidos de secuencia conocida en sus extremos para que se adsorba por hibridación a una superficie, las bases incorporadas al ADN se pueden detectar de manera directa, durante su síntesis, mediante marcado fluorescente diferencial de los cuatro posibles nucleótidos del ADN (Bentley et al., 2008).

Otra forma de detectar la incorporación de las bases de manera indirecta es midiendo los cambios de pH ocasionados por la producción de protones durante la polimerización o midiendo la concentración del pirofosfato producido durante la polimerización (método 454) (Rothberg et al., 2011; Margulies et al., 2005). Mediante el uso de plataformas manométricas, se pueden secuenciar simultáneamente decenas de millones de fragmentos cortos de 37-200 bases, dependiendo del método. En estos métodos se ha sacrificado la longitud del fragmento secuenciado por el número de fragmentos que se secuencian.

La secuenciación por síntesis permite la re-secuenciación de genomas haciendo realidad la medicina genómica personalizada donde se pueden buscar marcadores o descubrir alelos responsables de enfermedades genéticas en individuos (Ng et al., 2010). Todo esto ha sido posible gracias al diseño de plataformas que emplean semiconductores y nanopotenciometros, abaratando así la impresionante capacidad de secuenciación moderna (Rothberg et al., 2011).

En un futuro no muy lejano se espera contar con un proceso rutinario de secuenciación de moléculas simples sin necesidad de obtener los amplicones; así como para secuenciación masiva no requerir del ADN para preparar librerías genómicas (Kircher and Kelso, 2010). Algunos investigadores como Li & Harkess (2018) preguntan ¿Cuál es el mejor método para secuenciar un genoma de una planta de   1 Gbp?; ya que es difícil dar una respuesta clara y concisa de que método es el mejor. Sin embargo, Paajanen et al. (2017) emplearon la mayoría de los métodos (a excepción de Nanopore) para ensamblar el genoma de Solanum verrucosum Schltdl., y con esto identificar cuál de las metodologías empleadas es más útil.

CONCLUSIONES

Las nuevas metodologías de secuenciación ofrecen una gran variedad de aplicaciones para diferentes tipos de proyectos. Sin embargo, aún tienen algunas limitaciones que se deben tomar en cuenta, principalmente con el tamaño del gen o genoma y del tipo de secuencias que lo componen.

Los métodos de secuenciación de ADN son herramientas básicas para estudios moleculares y genómicos.

Es un paso importante considerar la toma de la muestra como su posterior transporte al laboratorio y conservación.

La calidad de las secuencias que se obtengan mediante secuenciación dependerá en gran medida de los protocolos de extracción, purificación y cuantificación fiables que permitan verificar la integridad y concentración.

La calidad de los datos obtenidos mediante secuenciación dependerá en gran medida de la pureza y correcta cuantificación del ADN.

REFERENCIAS

Bayley H. Sequencing single molecules of DNA. Current Opinion in Chemical Biology 2006;10(6):628–37

Bentley, D. R., Balasubramanian, S., et al., Accurate whole genome sequencing using reversible terminator chemistry, Nature, 456(7218), 53-59, 2008.

Bolívar-Zapata, F. G., Fundamentos y casos exitosos de la biotecnología moderna. México D.F, México: El Colegio Nacional, 2004.

Gut, I. G. (2013). New sequencing technologies. Clinical and Translational Oncology, 15(11), 879–881.

Kircher, M., & Kelso, J. (2010). High-throughput DNA sequencing, concepts and limitations. Bioessays, 32(6), 524-536.

Li, F.-W., & A. Harkess. (2018). A guide to sequence your favorite plant genomes. Applications in Plant Sciences 6(3): e1030.

López De Heredia Larrea, Unai (2016). Las técnicas de secuenciación masiva en el estudio de la diversidad biológica. Munibe Ciencias Naturales, v. 64 ; pp. 7-31.

Margulies, M., Egholm, M., et al., Genome sequencing in open microfabricated high density picoliter reactions, Nature, 437(7057), 376-380, 2005.

McGinn, S., & Gut, I. G. (2013). DNA sequencing – spanning the generations. New Biotechnology, 30(4), 366–372.

Ng, S. B., Buckingham, J. J., et al., Exome sequencing identifies the cause of a Mendelian disorder, Nature Genetics, 42(1), 30-35, 2010.

Paajanen, P., G. Kettleborough, E. Lopez-Girona, M. Giolai, D. Heavens, D. Baker, A. Lister, et al. (2017). A critical comparison of technologies for a plant genome sequencing project. bioRxiv

Rothberg, J.M., Hinz, W., et al., An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing, Nature, 475, 348-352, 2011.

Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977a). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(12), 5463-5467.

Sanger, F. et al. (1977b). Nucleotide sequence of bacteriophage   X174 DNA. Nature 265, 687–695.

https://genotipia.com/sanger/

https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimiento71.pdf