Opciones Diagnósticas para Influenza Aviar

La influenza aviar continúa siendo una de las enfermedades con mayor impacto económico en la avicultura a nivel mundial. Esto porque es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta a las aves domésticas y silvestres.

El virus de influenza se agrupa en tres tipos: A, B y C. La influenza tipo A es la única que tiene la capacidad de infectar a las aves y es potencialmente zoonótica. Los humanos se ven afectados por el tipo A, (el cuadro clínico puede complicarse hasta un caso grave) B y C, cursando generalmente con una enfermedad leve. Una característica importante de los virus de influenza aviar, es que existe una gran variabilidad a pesar de que todos pertenecen al género Influenzavirus A, de la familia Orthomyxoviridae.

La asignación de subtipo de los virus de influenza se hace con base en dos antígenos de superficie, las glicoproteínas hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). A la fecha han sido identificados 18 hemaglutininas (H1 - H18) y once neuraminidasas (N1 - N11). De éstos, H1 - H16 y N1-N9 han sido identificados en aves, y los restantes dos (H17-H18 / N10-N11), solamente se han aislado en murciélagos.    

Las cepas que afectan a las aves domésticas se clasifican de acuerdo al cuadro clínico:

• Influenza aviar de baja patogenicidad (IABP) que cursa con enfermedad leve o inclusive asintomática (infección focalizada, normalmente digestiva o respiratoria).

• Influenza aviar de alta patogenicidad (IAAP) que provoca signos clínicos graves con alta tasa de mortalidad (infección sistémica).

Actualmente los virus de alta patogenicidad que afectan gravemente la avicultura únicamente han sido los subtipos H5 y H7.   

Existe la creencia general de que los virus de IAAP pueden surgir a partir de los virus de baja patogenicidad. Aunque los virus pueden volverse endémicos, es conocido que los reservorios naturales del virus son las aves silvestres, especialmente las aves migratorias; lo que dificulta su erradicación.

Debido al potencial zoonótico del virus, los brotes de influenza aviar continúan siendo una preocupación de salud pública global y la enfermedad es de reporte obligatorio.

PREVENCIÓN Y CONTROL

Considerando la existencia de los reservorios naturales, el estándar internacional indica como principales medidas de control de la diseminación lo siguiente:

• Detección temprana

• Sacrificio sanitario de parvadas positivas

• Cuarentena perimetral

• Monitoreo y vigilancia

• Regulación del comercio

• Contar con medidas de bioseguridad

En el caso de que la vacunación se implemente (en zonas endémicas) es importante considerar que:

- No existe óptima protección cruzada entre subtipos

- Debido al alto riesgo de mutación y recombinación viral no es segura la aplicación de vacunas con virus activo atenuado

- Las vacunas a partir de virus inactivado pueden generar buena protección, pero necesitan ser homólogas a las cepas de campo

- Los anticuerpos generados por la vacunación, no pueden ser diferenciados serológicamente de los provocados por un desafío.

DIAGNÓSTICO           

El diagnóstico debe realizarse a partir de pruebas confirmatorias ya que clínicamente los signos y las lesiones son comunes con otras enfermedades. Adicionalmente no hay que olvidar que pueden existir infecciones simultáneas de influenza y otros virus aviares.

Es importante tomar en cuenta el fundamento de las pruebas de laboratorio, para hacer una adecuada interpretación. De manera general, las pruebas comúnmente utilizadas para el diagnóstico de la influenza aviar están orientadas ya sea a la detección del antígeno viral, o bien, a la detección de anticuerpos contra éste.

DETECCIÓN DEL VIRUS

La detección viral de influenza se realiza con el objetivo de determinar la circulación de virus en la parvada. Es importante tomar en cuenta las características propias de la prueba ya que algunas detectan la presencia del virus, pero no si tiene actividad biológica. A continuación, se enlistan algunos de los ejemplos más comunes:

Aislamiento viral

Se fundamenta en el aislamiento del agente hemaglutinante en huevos embrionados. Es útil para incrementar la carga viral, lo que permite analizar características del virus tales como la identificación del subtipo, determinar la virulencia con el método de índice de patogenicidad intravenosa, así como muchas otras evaluaciones ya que se recupera al virus activo. Las partículas virales obtenidas pueden utilizarse para amplificar, secuenciar y determinar por el análisis del sitio de corte de la hemaglutinina si el virus tiene un patrón amino-acídico de baja o alta patogenicidad.

RT-PCR. Reacción en cadena de la polimerasa

Está técnica se basa en la retrotranscipción (RT) del ARN viral en ADN complementario (ADNc) que posteriormente es amplificada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR.) Es muy sensible dada la replicación exponencial de la secuencia viral específica. Requiere que al menos algunas copias de una hebra de ARN estén intactas. Sin embargo, puede que estén presentes sin que el virus en la muestra original tenga actividad biológica.

Los primers usados pueden estar dirigido a la proteína M, detectando todos los subtipos virus de influenza A, o bien ser específicas por subtipos.  

Análisis de secuenciación / Análisis filogenético

Se determina la secuencia específica viral. Se dirige ya sea a la proteína matriz o bien para la hemaglutinina o cualquier proteína de interés. A partir de los resultados es posible la construcción de árboles filogenéticos que son muy relevantes dada la diversidad genética del virus de influenza aviar que ocurre por la variación antigénica del virus incluyendo las variaciones menores (antigenic drift), y las variaciones mayores (antigenic shift). Puede realizarse a partir de virus inactivos.

Un árbol filogenético es una representación gráfica de la relación estimada entre taxones y sus ancestros comunes hipotéticos. Son actualmente utilizados para estudiar como los procesos epidemiológicos, inmunológicos y evolutivos influencian e interactúan para afectar la transmisión y evolución. Un árbol filogenético está compuesto de ramas y nodos; las ramas conectan los nodos y un nodo es el punto en donde dos o más ramas divergen. Las ramas representan linajes genéticos a través del tiempo; y cada nodo representa la emergencia de un nuevo linaje genético.  Las ramas o nodos pueden ser internos (más cercanos a la raíz del árbol) o terminales (sin ramas descendentes, o éstas están alejadas de la raíz). Cuando las ramas y nodos son terminales, estos son referidos como "externos". Cada nodo interno en una filogenia corresponde a un ancestro común hipotético de todos los taxones emergiendo de ese nodo.

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIRUS

Mediante estas pruebas se puede determinar indirectamente si las aves han estado en contacto con el antígeno viral. Se orientan a detectar seroconversión, entendida como la transición de negativo a positivo, o bien, un aumento en el nivel de anticuerpos de al menos 4 veces hacia un antígeno específico.

Las pruebas serológicas deben cumplir con los criterios de alta especificidad y alta sensibilidad. Considerar que para que los anticuerpos sean formados por las células plasmáticas y sean detectables toma tiempo, entre 5 -7 días posteriores al contacto con el antígeno. En el caso de las vacunas inactivadas toma entre 10-14 días postvacunación. Se deben establecer líneas base para el nivel de anticuerpos maternos, y los títulos vacunales con o sin presencia de anticuerpos maternos y dependiendo de la edad de las aves; también se debe considerar que existen diferencias en la inmunogenicidad de los diferentes subtipos.

Las pruebas habituales son:

ELISA. Inmunoenzayo ligado a enzimas

La mayoría de las pruebas disponibles comercialmente son ELISA de bloqueo o competitivo. Esta prueba utiliza anticuerpos monoclonales marcados con una enzima, que reconocen un epítope altamente conservado de la nucleoproteína viral (NP) del virus de influenza A. El fundamento de la prueba es la unión antígeno- anticuerpo, el antígeno utilizado es NP, el cual se fija al fondo de las placas utilizadas en el ensayo, las placas se ponen en contacto con la muestra, los anticuerpos presentes se unen a los antígenos adheridos a la placa, posteriormente se añaden los anticuerpos monoclonales marcados, los cuales compiten con el anticuerpo de la muestra por los antígenos disponibles, así al realizarse la reacción enzimática el color generado en la reacción es inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-Influenza A en la muestra a analizar.  

Es muy útil para un monitoreo inicial y en principio puede detectar la presencia de anticuerpos contra diferentes subtipos. Inclusive siendo útil para el muestreo de diferentes especies aviares. Los resultados se expresan con la proporción en densidad óptica de la muestra con respecto al control negativo. A partir del punto de corte determinado las muestras son positivas o negativas.

HI- Inhibición de la hemoaglutinación

Esta prueba se fundamenta en el principio de que el virus aglutina eritrocitos y si hay anticuerpos presentes en la muestra el virus es neutralizado y por tanto no puede aglutinar a los eritrocitos. Es específica por serotipos, posee alta sensibilidad, aunque existen niveles bajos de falsos positivos (cuando no se utiliza el antígeno apropiado). Una vez que las aves entraron en contacto con el antígeno y los anticuerpos llegan a un nivel detectable, éstas continuarán arrojando resultados positivos por un tiempo largo (útil para monitoreo continuo y evaluación de vacunación). Se utilizan diluciones del suero para cuantificar el nivel de anticuerpos presentes. El título corresponde a la dilución más alta del suero que causa la inhibición completa de antígeno. Esto se valora inclinando las placas y comparando los pocillos en los cuales los eritrocitos se arrastran en la misma proporción que los pocillos control y en ellos se considera que hay inhibición de la aglutinación. Los títulos se consideran negativos si son menores o iguales a 1:4; sospechosos si son 1:8 y positivos títulos iguales o mayores a 1:16 (>24 o > 4 log2 expresado como el inverso). frente a un antígeno de 4UHA. Algunos laboratorios utilizan 8UHA en los ensayos HI lo cual está permitido según las recomendaciones de la OIE, aunque se debe ajustar la interpretación de tal modo que un título positivo es 1:8 (23 o 3 log2) o más alto.

Es importante tomar en cuenta que existen diferencias en resultados entre laboratorios debido al efecto técnico durante la realización de la prueba. Asimismo, puede existir una diferencia de varios grupos log al utilizar diferentes antígenos, dependiendo de la homología que tengan con el virus de campo.

En caso de presentarse un número bajo de positivos por HI puede deberse a:

• Falsos positivos

• Infección muy reciente con el mismo serotipo, pero poca homología entre el antígeno HI usado y la cepa de campo.

• Reacción cruzada con otro serotipo de IA (ej. anticuerpos contra la neuraminidasa). En cuyo caso, de ser posible debe usarse un antígeno extra contra el mismo subtipo de Hemaglutinina, pero diferente Neuraminidasa

Precipitación en gel de Agar

Se fundamenta en que los anticuerpos contra influenza pueden ser evidenciados por las líneas formadas por la precipitación del complejo inmune (formado entre los antígenos de referencia y los anticuerpos presentes en los sueros muestra). El ensayo se realiza en gel o agar en donde se recortan pocillos en un patrón conocido, con el antígeno al centro. Se coloca en ellos cada suero sospechoso junto a un suero y un antígeno positivo conocido. Esto creará una línea continua de identidad entre éstos. Las líneas de precipitina son detectables después de aproximadamente 24-48 horas. Un resultado positivo es cuando la línea de precipitina entre el pocillo del control positivo se continúa con la línea entre el antígeno y el pocillo problema. Las líneas cruzadas ocurren cuando el suero problema no tiene identidad con los anticuerpos del pocillo del control positivo. Es muy específica, pero de sensibilidad limitada.     

MUESTREO

La calidad de los resultados de las pruebas depende directamente de la calidad de la muestra. El transporte de éstas debe ser lo más rápido posible antes de su procesamiento, en condiciones de refrigeración 4 - 8°C. Todas deben incluir la información mínima necesaria para su trazabilidad. Las muestras recomendadas son:

Serología

Muestreo sanguíneo en tubos sin anticoagulante a partir de un mínimo de 20 aves. Importante dejar coagular y posteriormente separar el suero en un recipiente hermético. Las muestras son viables para su procesamiento hasta 5 días después siempre y cuando se mantengan refrigeradas. Si el tiempo hasta el proceso será mayor, los sueros deben mantenerse congelados a – 20°C. En condiciones de congelamiento pueden permanecer viables durante meses, siempre y cuando no se sometan a más de 3 – 5 ciclos de congelación/descongelación.

Aislamiento viral / PCR / Secuenciación

Pueden colectarse hisopos cloacales, orofaríngeos o traqueales a partir de aves preferentemente con signos clínicos, aunque pueden recolectarse a partir de aves vivas o muertas recientemente. Las aves muertas no deben mostrar signos de descomposición ya que esas muestras tienen un valor muy limitado para la detección y aislamiento del agente. Se recomienda usar hisopos secos en aves muertas e hisopos humedecidos con medio de transporte viral en aves vivas. Como medio de transporte puede usarse el caldo Tris triptosa-buferado o bien el caldo infusión cerebro corazón, ya que proveen de estabilidad adicional al virus.

Los hisopos sintéticos (rayón / dacrón) son preferibles a los de algodón ya que estos últimos pueden contener sustancias tóxicas o inhibidoras para el virus. Debe utilizarse un hisopo por ave. Posteriormente se coloca el hisopo en tubos que contenga suficiente medio de transporte para sumergir los hisopos en 2 ml máximo de medio de transporte viral. Los hisopos pueden ser colectados en pool, colocando un máximo de 5 en un tubo y sumergiéndolos en 4-5 ml. de medio.

Los hisopos traqueales/orofaríngeos una vez insertados, deben raspar la mucosa. En el caso de los hisopos cloacales se debe insertar la cabeza completa del hisopo en la cloaca y, aplicando presión suave, rotarlo dos o tres veces dentro.

De igual manera, como otra muestra de elección para aislamiento viral, se pueden colectar y colocar en contenedores de plástico estériles: tráquea, pulmón, hígado, riñón, bazo, encéfalo y tonsilas cecales.

Las muestras deben ser refrigeradas inmediatamente y transportadas con refrigerantes al laboratorio. Si el transporte al laboratorio dentro de las primeras 48 horas. no está garantizado, las muestras deben ser congeladas y transportadas con hielo seco.

CONCLUSIONES:

• Indudablemente las medidas para el control de la influenza aviar deben ser integrales y de acuerdo a los estándares internacionales y a las características propias de la región.

• Hasta el momento, las pruebas serológicas son muy útiles por su alta sensibilidad y especificidad, sin embargo, se esperan diferencias en los títulos de acuerdo a la homología con la cepa de campo circulante.

• Actualmente existen pruebas para detección de antígeno muy eficientes disponibles, sin embargo, la utilidad de los resultados dependerá de la interpretación adecuada de los mismos. Particularmente se debe enfatizar que resultados de pruebas como PCR y secuenciación no son evidencia de que el agente tenía actividad biológica en la muestra. Para ese propósito, únicamente el aislamiento viral es indicativo de esto.

• Igualmente, de acuerdo a la historia natural de la enfermedad, puede haber aves en diferentes estadios de infección. Por lo que es de esperarse en algunos casos resultados aparentemente contradictorios entre las pruebas para detección de anticuerpos y las de detección de antígeno.

• Finalmente, debido a la alta variabilidad genética del virus y que históricamente siguen surgiendo nuevos virus de IAAP a nivel mundial, es muy importante continuar vigilando la aparición de cepas de campo nuevas mediante el monitoreo continuo de las parvadas.

Bibliografía.

1.- World Organisation for Animal Health (OIE) https://www.oie.int/es/sanidad-animal-en-el-mundo/portal-sobre-la-influenza-aviar/

2.- Avian influenza and newcastle disease. A field and Laboratory Manual. Editors Ilaria Capua, Dennis J. Alexander

3.- Fundamentals of phylogenetic trees and sequence analysis tools for the analyses of swine influenza A viruses. Tavis K. Anderson, PhD; Rasna R. Walia, PhD, Amy L. Vincent, DVM, PhD. Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA ARS, Ames, Iowa

4.- Organización Mundial de Sanidad Animal. Manual De Las Pruebas De Diagnóstico Y De Las Vacunas Para Los Animales Terrestres (Mamíferos, Aves Y Abejas). Volumen I. Capítulo 3.3.4. 2018.

5.- Organización Mundial de Sanidad Animal. Código Sanitario para los Animales Terrestres. Volumen II. Capítulo 10.4. 2019

6.- American Association of avian Pathologists. A Laboratory Manual For The Isolation, Identification And Characterization Of Avian Pathogens. 6th Edition 2016.